एंटीबॉडी के उत्पादन के सर्वोत्तम प्रभाव को प्राप्त करने के लिए एंटीजन पॉलीपेप्टाइड को सावधानीपूर्वक डिजाइन करना आवश्यक है, और डिजाइन को एक बुनियादी शर्त को पूरा करना चाहिएः प्रतिरक्षा की प्रक्रिया में,एंटीजन अत्यधिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न नहीं करेगा, और साथ ही यह एंटीबॉडी उत्पन्न कर सकता है जो रुचि के प्रोटीन से बंधते हैं।
आम तौर पर यह अनुशंसा की जाती है कि एंटीजेनिक पॉलीपेप्टाइड की अनुक्रम लंबाई 8-20 अमीनो एसिड अवशेषों के बीच हो।यह जोखिम है कि पॉलीपेप्टाइड की विशिष्टता मजबूत नहीं होगी और उत्पन्न एंटीबॉडी और देशी प्रोटीन के बीच बंधन क्षमता पर्याप्त मजबूत नहीं होगीहालांकि, यदि अनुक्रम की लंबाई 20 से अधिक है, तो माध्यमिक संरचना को पेश करना संभव होगा, और परिणामी एंटीबॉडी अपनी विशिष्टता खो सकती है, और पेप्टाइड श्रृंखला जितनी लंबी होगी,संश्लेषण करना अधिक कठिन है, और उच्च शुद्धता वाले उत्पादों को प्राप्त करना मुश्किल है। कठिन पेप्टाइड्स के संश्लेषण में समृद्ध अनुभव के साथ,केएस-वी पेप्टाइड आपके अनुसंधान और विकास में सहायता के लिए उच्च शुद्धता वाले तैयार एंटीजन पेप्टाइड को कुशलतापूर्वक और जल्दी से प्रदान कर सकता है.
यद्यपि प्रोटीन के अधिकांश छोटे, रैखिक पेप्टाइड टुकड़े जलीय घोल में असंरचित होते हैं,कई इम्यूनोजेनिक और एंटीजेनिक पेप्टाइड्स में संरचित रूपों के लिए संरचनात्मक प्राथमिकताएं दिखाई गई हैंमुख्य रूप से एनएमआर और सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके, बीटा-टर्न, हेलिकल और नवजात हेलिकल संरचनाओं की काफी छोटी आबादी का पता लगाना और मात्रात्मक रूप देना संभव हो गया है।हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि संरचित रूपों की उपस्थिति पेप्टाइड अनुक्रमों में टी सेल और/या बी सेल एपिटोप के स्थान से जुड़ी हुई है।पेप्टाइड और एंटीपेप्टाइड एंटीबॉडी के बीच के जटिलों के एक्स-रे क्रिस्टल संरचनाएं अक्सर पेप्टाइड को बीटा-टर्न संरचनाओं में बंधा दिखाती हैं,और एक पेप्टाइड-एंटीबॉडी परिसर में हेलिक्स की उपस्थिति एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा दिखाया गया है. Studies of peptides free in solution and bound to anti-peptide antibodies in the crystal indicate that the structure of the principal neutralizing determinant of HIV-1 probably includes at least one beta-turn in a highly conserved regionइन परिणामों का संभावित रूप से पेप्टाइड आधारित टीकों के डिजाइन में उपयोग किया जा सकता है।
सबसे पहले, पेप्टाइड एंटीजन एंटीबॉडी जनरेशन के लिए एक स्मार्ट समाधान प्रदान करते हैं, ऐसे मामलों में जहां लक्ष्य प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम ज्ञात हैं, लेकिन प्रोटीन स्वयं उपलब्ध नहीं है,या संरचनात्मक रूप से स्थिर और अखंड प्रोटीन के रूप में प्राप्त करने के लिए संरचनात्मक रूप से बहुत जटिल (ईकुछ ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर्स, आयन चैनल आदि) ।पेप्टाइड इम्यूनोजेन दृष्टिकोण एक अतिरिक्त लाभ के रूप में लक्ष्य प्रोटीन के डोमेन के लिए एंटीजन के चयन और डिजाइन में लचीलापन प्रदान करता हैपेप्टाइड एंटीजेन लक्ष्य प्रोटीन पर पोस्ट-ट्रांसलेशनली संशोधित बाइंडिंग साइटों के खिलाफ एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए भी अत्यधिक उपयोगी हैं।
अन्य लाभ हैंः:
यद्यपि कई पेप्टाइड अनुक्रम प्रतिरक्षाजनक हो सकते हैं, लेकिन सभी लक्षित प्रोटीन के खिलाफ प्रतिक्रियाशीलता के साथ एंटीबॉडी उत्पन्न करने में समान रूप से प्रभावी नहीं हैं।पेप्टाइड एंटीजनों के साथ एंटीबॉडी का सफल निर्माण कई कारकों पर निर्भर करता है जिन्हें डिजाइन में विचार करने की आवश्यकता होती है, जिसमें निम्नलिखित शामिल हैंः
लक्ष्य प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम की सटीकता
अखंड प्रोटीन की पूर्वानुमानित 2ary / 3ary संरचना
पेप्टाइड एंटीजन द्वारा अनुकरण किए जाने वाले प्रोटीन के डोमेन/क्षेत्रों का चयन
एक बड़े वाहक प्रोटीन के लिए पेप्टाइड एंटीजन conjugating की आवश्यकता
कुछ पेप्टाइड अनुक्रमों के संश्लेषण की आसानी
इसलिए पेप्टाइड एंटीजन के डिजाइन के लिए निम्नलिखित सामान्य सिफारिशें लागू होती हैं:
सुनिश्चित करें कि सही प्रजाति और प्रोटीन अनुक्रम की पहचान की गई है।
पेप्टाइड एंटीजन का चयन मूल प्रोटीन के विलायक-पहुंचने योग्य क्षेत्र से किया जाता है।ये प्रोटीन सतह पर उजागर क्षेत्र हैं जो विलायक के जलीय (हाइड्रोफिलिक) वातावरण के संपर्क में हैंप्रोटीन के कुछ क्षेत्र एंटीबॉडीज के लिए अनुपलब्ध हो सकते हैं, जैसे ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र या एक गोलाकार प्रोटीन का केंद्र।
एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि पेप्टाइड एंटीजन को एक विशिष्ट रुचि के एपिटोप को कवर करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। पेप्टाइड एंटीजन उम्मीदवारों को एक विशिष्ट प्रोटीन डेटाबेस के खिलाफ स्क्रीनिंग किया जाता है।कुछ डोमेन अन्य प्रोटीन में भी मौजूद हो सकते हैंअवांछित क्रॉस-रिएक्टिविटी की संभावना को कम करने और इस प्रकार आपके समग्र एंटीबॉडी-विशिष्टता को अनुकूलित करने के लिए इन अनुक्रमों से बचना चाहिए।कम से कम अनुक्रम समरूपता वाले अनुक्रमों का चयन अवांछित लक्ष्य प्रोटीन बंधन को कम करने के लिए सबसे अच्छा है.
अखंड प्रोटीन में लक्षित डोमेन की 3 डी संरचना के आधार पर, एंटीजन की तृतीयक संरचना की इष्टतम नकल करने के लिए प्रतिबंधात्मक तकनीकों की आवश्यकता हो सकती है।प्रोटीन सतह अनुकरण में विशेषज्ञ के रूप में, केएस-वी के पास संरचनात्मक रूप से प्रतिबंधित पेप्टाइड एंटीजन के डिजाइन और संश्लेषण के लिए विभिन्न (आंशिक रूप से मालिकाना) प्रौद्योगिकियां उपलब्ध हैं।
जीन्स अक्सर KLH, BSA या OVA जैसे वाहक प्रोटीन के साथ पूर्व संयुग्मन के बिना एक महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए बहुत छोटे होते हैं।इसलिए आमतौर पर पेप्टाइड ∙ वाहक प्रोटीन conjugates का प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है।.
पेप्टाइड एंटीजनों के डिजाइन के लिए विशिष्ट पेप्टाइड अनुक्रमों के संश्लेषण की आसानी पर भी विचार किया जाना चाहिए। हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोफिलिक अवशेष दोनों को शामिल किया जाना चाहिए,और यह पेप्टाइड के लिए अमीनो एसिड को शामिल करने के लिए अनुकूल है जो प्रतिरक्षा-प्रवर्धन हैं (जैसे बुनियादी और सुगंधित अमीनो एसिड). हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड सामग्री को 50% से कम रखा जाना चाहिए और हाइड्रोफोबिक अवशेषों की लंबी श्रृंखलाओं से भी परहेज किया जाना चाहिए। पेप्टाइड घुलनशीलता के लिए,कम से कम एक आवेशित अवशेष (आर्गिनिन), ग्लूटामाइन, एस्पार्टिक एसिड, या लिसाइन) को हर पांच अमीनो एसिड में शामिल किया जाना चाहिए।पेप्टाइड घुलनशीलता को संरक्षक प्रतिस्थापन या एन- या सी-टर्मिनस में ध्रुवीय अवशेषों के अतिरिक्त भी बढ़ाया जा सकता हैएंटीजनों को डिजाइन करते समय, बीटा-शीट या अल्फा-हेलिक्स जैसे जटिल क्षेत्रों से बचना चाहिए, बल्कि लचीले क्षेत्रों का लक्ष्य रखा जाना चाहिए।
केएस-वी पेप्टाइड एंटीजन के संश्लेषण के लिए अपनी अत्याधुनिक क्षमताओं और विशेषज्ञता को लागू करता है, जिसमें (यदि आवश्यक हो तो) संरचनात्मक बाधाएं, पीटीएम ्स, संयुग्मन या बायोटिनिलेशन शामिल हैं।अधिकांश एंटीबॉडी जनरेशन परियोजनाओं के लिए किसी भी पेप्टाइड एंटीजन के लिए कम से कम 85% शुद्धता की सिफारिश की जाती है. हालांकि, यदि वांछित हम उच्च शुद्धता के साथ एंटीजन प्रदान कर सकते हैं भी. हम आम तौर पर पेप्टाइड के लगभग 10 मिलीग्राम संश्लेषित करेंगे, जो आमतौर पर प्रोटीन-संयोजन के लिए पर्याप्त है,एलिसा स्क्रीनिंग और यदि वांछित हो तो एक आत्मीयता मैट्रिक्स क्रोमैटोग्राफी सेटअप का निर्माण.
एंटीबॉडी के उत्पादन के सर्वोत्तम प्रभाव को प्राप्त करने के लिए एंटीजन पॉलीपेप्टाइड को सावधानीपूर्वक डिजाइन करना आवश्यक है, और डिजाइन को एक बुनियादी शर्त को पूरा करना चाहिएः प्रतिरक्षा की प्रक्रिया में,एंटीजन अत्यधिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न नहीं करेगा, और साथ ही यह एंटीबॉडी उत्पन्न कर सकता है जो रुचि के प्रोटीन से बंधते हैं।
आम तौर पर यह अनुशंसा की जाती है कि एंटीजेनिक पॉलीपेप्टाइड की अनुक्रम लंबाई 8-20 अमीनो एसिड अवशेषों के बीच हो।यह जोखिम है कि पॉलीपेप्टाइड की विशिष्टता मजबूत नहीं होगी और उत्पन्न एंटीबॉडी और देशी प्रोटीन के बीच बंधन क्षमता पर्याप्त मजबूत नहीं होगीहालांकि, यदि अनुक्रम की लंबाई 20 से अधिक है, तो माध्यमिक संरचना को पेश करना संभव होगा, और परिणामी एंटीबॉडी अपनी विशिष्टता खो सकती है, और पेप्टाइड श्रृंखला जितनी लंबी होगी,संश्लेषण करना अधिक कठिन है, और उच्च शुद्धता वाले उत्पादों को प्राप्त करना मुश्किल है। कठिन पेप्टाइड्स के संश्लेषण में समृद्ध अनुभव के साथ,केएस-वी पेप्टाइड आपके अनुसंधान और विकास में सहायता के लिए उच्च शुद्धता वाले तैयार एंटीजन पेप्टाइड को कुशलतापूर्वक और जल्दी से प्रदान कर सकता है.
यद्यपि प्रोटीन के अधिकांश छोटे, रैखिक पेप्टाइड टुकड़े जलीय घोल में असंरचित होते हैं,कई इम्यूनोजेनिक और एंटीजेनिक पेप्टाइड्स में संरचित रूपों के लिए संरचनात्मक प्राथमिकताएं दिखाई गई हैंमुख्य रूप से एनएमआर और सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके, बीटा-टर्न, हेलिकल और नवजात हेलिकल संरचनाओं की काफी छोटी आबादी का पता लगाना और मात्रात्मक रूप देना संभव हो गया है।हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि संरचित रूपों की उपस्थिति पेप्टाइड अनुक्रमों में टी सेल और/या बी सेल एपिटोप के स्थान से जुड़ी हुई है।पेप्टाइड और एंटीपेप्टाइड एंटीबॉडी के बीच के जटिलों के एक्स-रे क्रिस्टल संरचनाएं अक्सर पेप्टाइड को बीटा-टर्न संरचनाओं में बंधा दिखाती हैं,और एक पेप्टाइड-एंटीबॉडी परिसर में हेलिक्स की उपस्थिति एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा दिखाया गया है. Studies of peptides free in solution and bound to anti-peptide antibodies in the crystal indicate that the structure of the principal neutralizing determinant of HIV-1 probably includes at least one beta-turn in a highly conserved regionइन परिणामों का संभावित रूप से पेप्टाइड आधारित टीकों के डिजाइन में उपयोग किया जा सकता है।
सबसे पहले, पेप्टाइड एंटीजन एंटीबॉडी जनरेशन के लिए एक स्मार्ट समाधान प्रदान करते हैं, ऐसे मामलों में जहां लक्ष्य प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम ज्ञात हैं, लेकिन प्रोटीन स्वयं उपलब्ध नहीं है,या संरचनात्मक रूप से स्थिर और अखंड प्रोटीन के रूप में प्राप्त करने के लिए संरचनात्मक रूप से बहुत जटिल (ईकुछ ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर्स, आयन चैनल आदि) ।पेप्टाइड इम्यूनोजेन दृष्टिकोण एक अतिरिक्त लाभ के रूप में लक्ष्य प्रोटीन के डोमेन के लिए एंटीजन के चयन और डिजाइन में लचीलापन प्रदान करता हैपेप्टाइड एंटीजेन लक्ष्य प्रोटीन पर पोस्ट-ट्रांसलेशनली संशोधित बाइंडिंग साइटों के खिलाफ एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए भी अत्यधिक उपयोगी हैं।
अन्य लाभ हैंः:
यद्यपि कई पेप्टाइड अनुक्रम प्रतिरक्षाजनक हो सकते हैं, लेकिन सभी लक्षित प्रोटीन के खिलाफ प्रतिक्रियाशीलता के साथ एंटीबॉडी उत्पन्न करने में समान रूप से प्रभावी नहीं हैं।पेप्टाइड एंटीजनों के साथ एंटीबॉडी का सफल निर्माण कई कारकों पर निर्भर करता है जिन्हें डिजाइन में विचार करने की आवश्यकता होती है, जिसमें निम्नलिखित शामिल हैंः
लक्ष्य प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम की सटीकता
अखंड प्रोटीन की पूर्वानुमानित 2ary / 3ary संरचना
पेप्टाइड एंटीजन द्वारा अनुकरण किए जाने वाले प्रोटीन के डोमेन/क्षेत्रों का चयन
एक बड़े वाहक प्रोटीन के लिए पेप्टाइड एंटीजन conjugating की आवश्यकता
कुछ पेप्टाइड अनुक्रमों के संश्लेषण की आसानी
इसलिए पेप्टाइड एंटीजन के डिजाइन के लिए निम्नलिखित सामान्य सिफारिशें लागू होती हैं:
सुनिश्चित करें कि सही प्रजाति और प्रोटीन अनुक्रम की पहचान की गई है।
पेप्टाइड एंटीजन का चयन मूल प्रोटीन के विलायक-पहुंचने योग्य क्षेत्र से किया जाता है।ये प्रोटीन सतह पर उजागर क्षेत्र हैं जो विलायक के जलीय (हाइड्रोफिलिक) वातावरण के संपर्क में हैंप्रोटीन के कुछ क्षेत्र एंटीबॉडीज के लिए अनुपलब्ध हो सकते हैं, जैसे ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र या एक गोलाकार प्रोटीन का केंद्र।
एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि पेप्टाइड एंटीजन को एक विशिष्ट रुचि के एपिटोप को कवर करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। पेप्टाइड एंटीजन उम्मीदवारों को एक विशिष्ट प्रोटीन डेटाबेस के खिलाफ स्क्रीनिंग किया जाता है।कुछ डोमेन अन्य प्रोटीन में भी मौजूद हो सकते हैंअवांछित क्रॉस-रिएक्टिविटी की संभावना को कम करने और इस प्रकार आपके समग्र एंटीबॉडी-विशिष्टता को अनुकूलित करने के लिए इन अनुक्रमों से बचना चाहिए।कम से कम अनुक्रम समरूपता वाले अनुक्रमों का चयन अवांछित लक्ष्य प्रोटीन बंधन को कम करने के लिए सबसे अच्छा है.
अखंड प्रोटीन में लक्षित डोमेन की 3 डी संरचना के आधार पर, एंटीजन की तृतीयक संरचना की इष्टतम नकल करने के लिए प्रतिबंधात्मक तकनीकों की आवश्यकता हो सकती है।प्रोटीन सतह अनुकरण में विशेषज्ञ के रूप में, केएस-वी के पास संरचनात्मक रूप से प्रतिबंधित पेप्टाइड एंटीजन के डिजाइन और संश्लेषण के लिए विभिन्न (आंशिक रूप से मालिकाना) प्रौद्योगिकियां उपलब्ध हैं।
जीन्स अक्सर KLH, BSA या OVA जैसे वाहक प्रोटीन के साथ पूर्व संयुग्मन के बिना एक महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए बहुत छोटे होते हैं।इसलिए आमतौर पर पेप्टाइड ∙ वाहक प्रोटीन conjugates का प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है।.
पेप्टाइड एंटीजनों के डिजाइन के लिए विशिष्ट पेप्टाइड अनुक्रमों के संश्लेषण की आसानी पर भी विचार किया जाना चाहिए। हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोफिलिक अवशेष दोनों को शामिल किया जाना चाहिए,और यह पेप्टाइड के लिए अमीनो एसिड को शामिल करने के लिए अनुकूल है जो प्रतिरक्षा-प्रवर्धन हैं (जैसे बुनियादी और सुगंधित अमीनो एसिड). हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड सामग्री को 50% से कम रखा जाना चाहिए और हाइड्रोफोबिक अवशेषों की लंबी श्रृंखलाओं से भी परहेज किया जाना चाहिए। पेप्टाइड घुलनशीलता के लिए,कम से कम एक आवेशित अवशेष (आर्गिनिन), ग्लूटामाइन, एस्पार्टिक एसिड, या लिसाइन) को हर पांच अमीनो एसिड में शामिल किया जाना चाहिए।पेप्टाइड घुलनशीलता को संरक्षक प्रतिस्थापन या एन- या सी-टर्मिनस में ध्रुवीय अवशेषों के अतिरिक्त भी बढ़ाया जा सकता हैएंटीजनों को डिजाइन करते समय, बीटा-शीट या अल्फा-हेलिक्स जैसे जटिल क्षेत्रों से बचना चाहिए, बल्कि लचीले क्षेत्रों का लक्ष्य रखा जाना चाहिए।
केएस-वी पेप्टाइड एंटीजन के संश्लेषण के लिए अपनी अत्याधुनिक क्षमताओं और विशेषज्ञता को लागू करता है, जिसमें (यदि आवश्यक हो तो) संरचनात्मक बाधाएं, पीटीएम ्स, संयुग्मन या बायोटिनिलेशन शामिल हैं।अधिकांश एंटीबॉडी जनरेशन परियोजनाओं के लिए किसी भी पेप्टाइड एंटीजन के लिए कम से कम 85% शुद्धता की सिफारिश की जाती है. हालांकि, यदि वांछित हम उच्च शुद्धता के साथ एंटीजन प्रदान कर सकते हैं भी. हम आम तौर पर पेप्टाइड के लगभग 10 मिलीग्राम संश्लेषित करेंगे, जो आमतौर पर प्रोटीन-संयोजन के लिए पर्याप्त है,एलिसा स्क्रीनिंग और यदि वांछित हो तो एक आत्मीयता मैट्रिक्स क्रोमैटोग्राफी सेटअप का निर्माण.
