क्रायो-ईएम क्या है और यह कैसे काम करता है?
क्रिओ-ईएम में, शोधकर्ता कोशिका, वायरस, आणविक जटिल या किसी अन्य संरचना को जल्दी से फ्रीज करते हैं ताकि पानी के अणुओं को क्रिस्टल बनाने का समय न मिले। इससे नमूना अपनी प्राकृतिक स्थिति में बरकरार रहता है।वैज्ञानिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जमे हुए नमूने को इलेक्ट्रॉन बीम से उड़ा देते हैंयह एक डिजिटल डिटेक्टर पर नमूना का दो आयामी प्रक्षेपण बनाता है।कई अलग अलग कोणों से नमूना के सैकड़ों प्रक्षेपण बनाने और फिर इन कोणों का औसत लेने सेहाल ही में क्रायो-ईएम में हुई प्रगति से प्रोटीन और अन्य जैविक संरचनाओं की अत्यधिक विस्तृत तस्वीरें प्राप्त होती हैं।जिसमें आरएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स जैसे बड़े संरचनाएं शामिल हैं.
क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (Cryo-EM) की शुरूआतः
पिछले एक दशक में, क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रियो-ईएम) ने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयार करने के पारंपरिक तरीकों की जगह तेजी से ले ली है।टेलर और ग्लेज़र और डुबोशेट और उनके सहयोगियों के अग्रणी कार्य ने इस विकास का मार्ग प्रशस्त किया।, जिसने जैविक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की एक क्वांटम छलांग पेश की क्योंकि इसने पूरी तरह से हाइड्रेटेड नमूनों की छवियों को एक स्थानीय स्थिति के करीब प्राप्त करने में सक्षम बनाया।
क्रिओ-ईएम शब्द का प्रयोग ग्लासियस आइस में एम्बेडेड नमूनों पर लागू होने पर विभिन्न ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग विधियों को संदर्भित करता है।क्रियो-ईएम की तीन प्रमुख शाखाएं आणविक संरचनात्मक जीव विज्ञान के संदर्भ में प्रासंगिक हैं: इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी, एकल कण विश्लेषण और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी।
इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी 4Å से नीचे 2D-क्रिस्टल बनाने वाले प्रोटीन की संरचना निर्धारित करने में लाभ प्रदान करती है (जैसे कि पानी परिवहन झिल्ली प्रोटीन - एक्वापोरीन के साथ दिखाया गया है) ।झिल्ली प्रोटीन विशेष रूप से 2D क्रिस्टल के गठन के लिए आशाजनक उम्मीदवार हैंहाल ही में 2 Å से अधिक संकल्प प्राप्त किए गए हैं। three dimensional electron crystallography of protein microcrystals (microED) has been developed and is showing promises in solving high resolutions structures of proteins forming tiny 3D-crystals (200 nm) usually not amenable for study by x-ray crystallography.
एकल कण विश्लेषण का उपयोग कई उप-इकाइयों के अलग और शुद्ध बड़े असेंबली के लिए किया जाता है जो अक्सर बहुत विषम, मेटास्टेबल और क्रिस्टलीकृत करने के लिए बेहद कठिन होते हैं (जैसेराइबोसोम या 26S प्रोटियोसोम) को नियमित रूप से 310 Å और सर्वोत्तम मामलों में 2 Å से कमनमूना आकार सीमाः 5-150 एनएम.
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी क्या है और यह कैसे काम करती है?
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी एक्स-रे की एक किरण को एक छोटे ठोस क्रिस्टल के माध्यम से शूट करती है जो खरबों समान प्रोटीन अणुओं से बना होता है। क्रिस्टल एक्स-रे को इलेक्ट्रॉनिक डिटेक्टर पर फैलाता है,डिजिटल कैमरे में छवियों को कैप्चर करने के तरीके के समानएक कंप्यूटर विकिरित एक्स-रे की तीव्रता को मापता है ताकि क्रिस्टलीकृत अणु में प्रत्येक परमाणु को एक स्थान दिया जा सके। परिणाम एक त्रि-आयामी डिजिटल छवि है।इस विधि का उपयोग ज्ञात प्रोटीन संरचनाओं के 85 प्रतिशत से अधिक को निर्धारित करने के लिए किया गया है.
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और क्रायो-ईएम के बारे में कुछ विवरणः
1छोटे प्रोटीन एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए अधिक उपयुक्त हैं क्योंकि उन्हें क्रायो-ईएम द्वारा भेद करना मुश्किल हो सकता है।
2एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी बहुत उच्च संकल्प प्राप्त कर सकती है, हालांकि हाल के वर्षों में क्रायो-ईएम के समान परिणाम मिले हैं।
3बड़ी संरचनाओं, परिसरों और झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टलीकृत करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इसलिए क्रायो-ईएम एक आसान विकल्प हो सकता है।
4ईएम (नकारात्मक दाग) एकत्रीकरण को बाहर करने और ओलिगोमेरीज़ेशन निर्धारित करने के लिए नमूनों की त्वरित स्क्रीनिंग प्रदान करता है, जिससे नमूना कैसे व्यवहार करता है और इसमें क्या होता है, इसका दृश्य अवलोकन होता है।
5क्रिओ-ईएम में एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी की तुलना में कम प्रोटीन की मात्रा की आवश्यकता होती है। यह विधि 2 मिलीग्राम प्रोटीन (<5-10 मिलीग्राम/एमएल) से कम उपज वाले नमूनों के लिए फायदेमंद हो सकती है।*
KS-V पेप्टाइड क्रायो-ईएमसेवा प्लेटफार्म:
क्रायो-ईएम क्या है और यह कैसे काम करता है?
क्रिओ-ईएम में, शोधकर्ता कोशिका, वायरस, आणविक जटिल या किसी अन्य संरचना को जल्दी से फ्रीज करते हैं ताकि पानी के अणुओं को क्रिस्टल बनाने का समय न मिले। इससे नमूना अपनी प्राकृतिक स्थिति में बरकरार रहता है।वैज्ञानिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जमे हुए नमूने को इलेक्ट्रॉन बीम से उड़ा देते हैंयह एक डिजिटल डिटेक्टर पर नमूना का दो आयामी प्रक्षेपण बनाता है।कई अलग अलग कोणों से नमूना के सैकड़ों प्रक्षेपण बनाने और फिर इन कोणों का औसत लेने सेहाल ही में क्रायो-ईएम में हुई प्रगति से प्रोटीन और अन्य जैविक संरचनाओं की अत्यधिक विस्तृत तस्वीरें प्राप्त होती हैं।जिसमें आरएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स जैसे बड़े संरचनाएं शामिल हैं.
क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (Cryo-EM) की शुरूआतः
पिछले एक दशक में, क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रियो-ईएम) ने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयार करने के पारंपरिक तरीकों की जगह तेजी से ले ली है।टेलर और ग्लेज़र और डुबोशेट और उनके सहयोगियों के अग्रणी कार्य ने इस विकास का मार्ग प्रशस्त किया।, जिसने जैविक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की एक क्वांटम छलांग पेश की क्योंकि इसने पूरी तरह से हाइड्रेटेड नमूनों की छवियों को एक स्थानीय स्थिति के करीब प्राप्त करने में सक्षम बनाया।
क्रिओ-ईएम शब्द का प्रयोग ग्लासियस आइस में एम्बेडेड नमूनों पर लागू होने पर विभिन्न ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग विधियों को संदर्भित करता है।क्रियो-ईएम की तीन प्रमुख शाखाएं आणविक संरचनात्मक जीव विज्ञान के संदर्भ में प्रासंगिक हैं: इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी, एकल कण विश्लेषण और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी।
इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी 4Å से नीचे 2D-क्रिस्टल बनाने वाले प्रोटीन की संरचना निर्धारित करने में लाभ प्रदान करती है (जैसे कि पानी परिवहन झिल्ली प्रोटीन - एक्वापोरीन के साथ दिखाया गया है) ।झिल्ली प्रोटीन विशेष रूप से 2D क्रिस्टल के गठन के लिए आशाजनक उम्मीदवार हैंहाल ही में 2 Å से अधिक संकल्प प्राप्त किए गए हैं। three dimensional electron crystallography of protein microcrystals (microED) has been developed and is showing promises in solving high resolutions structures of proteins forming tiny 3D-crystals (200 nm) usually not amenable for study by x-ray crystallography.
एकल कण विश्लेषण का उपयोग कई उप-इकाइयों के अलग और शुद्ध बड़े असेंबली के लिए किया जाता है जो अक्सर बहुत विषम, मेटास्टेबल और क्रिस्टलीकृत करने के लिए बेहद कठिन होते हैं (जैसेराइबोसोम या 26S प्रोटियोसोम) को नियमित रूप से 310 Å और सर्वोत्तम मामलों में 2 Å से कमनमूना आकार सीमाः 5-150 एनएम.
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी क्या है और यह कैसे काम करती है?
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी एक्स-रे की एक किरण को एक छोटे ठोस क्रिस्टल के माध्यम से शूट करती है जो खरबों समान प्रोटीन अणुओं से बना होता है। क्रिस्टल एक्स-रे को इलेक्ट्रॉनिक डिटेक्टर पर फैलाता है,डिजिटल कैमरे में छवियों को कैप्चर करने के तरीके के समानएक कंप्यूटर विकिरित एक्स-रे की तीव्रता को मापता है ताकि क्रिस्टलीकृत अणु में प्रत्येक परमाणु को एक स्थान दिया जा सके। परिणाम एक त्रि-आयामी डिजिटल छवि है।इस विधि का उपयोग ज्ञात प्रोटीन संरचनाओं के 85 प्रतिशत से अधिक को निर्धारित करने के लिए किया गया है.
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और क्रायो-ईएम के बारे में कुछ विवरणः
1छोटे प्रोटीन एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए अधिक उपयुक्त हैं क्योंकि उन्हें क्रायो-ईएम द्वारा भेद करना मुश्किल हो सकता है।
2एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी बहुत उच्च संकल्प प्राप्त कर सकती है, हालांकि हाल के वर्षों में क्रायो-ईएम के समान परिणाम मिले हैं।
3बड़ी संरचनाओं, परिसरों और झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टलीकृत करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इसलिए क्रायो-ईएम एक आसान विकल्प हो सकता है।
4ईएम (नकारात्मक दाग) एकत्रीकरण को बाहर करने और ओलिगोमेरीज़ेशन निर्धारित करने के लिए नमूनों की त्वरित स्क्रीनिंग प्रदान करता है, जिससे नमूना कैसे व्यवहार करता है और इसमें क्या होता है, इसका दृश्य अवलोकन होता है।
5क्रिओ-ईएम में एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी की तुलना में कम प्रोटीन की मात्रा की आवश्यकता होती है। यह विधि 2 मिलीग्राम प्रोटीन (<5-10 मिलीग्राम/एमएल) से कम उपज वाले नमूनों के लिए फायदेमंद हो सकती है।*
KS-V पेप्टाइड क्रायो-ईएमसेवा प्लेटफार्म:
